La criocirugia se esta utilizando como terapia para cancer en la prostata. Se basa en una lesion a la celula por la congelacion, esta celula es cancerosa. el tipo de daño a esta celula es determinado por la velocidad de enfriemiento. El enfriamiento rapido induce la formacion de hielo fuera de la celula antes de su propagacion dentro de la misma. Por lo tanto se puede decir que el mayor daño a la celula ocurre durante la congelacion,el determinante en la formacion de hielo intracelular es la temperatura de nucleacion, cuanto menor sea esta temperatura, la incidencia de formacion de hielo intracelular es mayor.
La congelacion afecta los lipidos de la membrana, las proteinas, los acidos nucleicos cambiando sus interacciones, estructura y funcion. el enfriamiento por su parte altera el estado fisico de lipidos alterando asi su organizacion y fluidez.
El cambio en la membrana puede derivar en fuga de solutos citoplasmaticos y las proteinad pueden ser atacadas por radicales libres y especies reactivas de oxigeno, tambien degradadas por proteasas procedentes de lisosomas que pierden la integridad de membrana en congelacion o descongelacion.
para el estudio de congelacion inducida a biomoleculas celulares y observar cambios en su conformacion se utilizo espectroscopia infrarroja (FTIR).
Para determinar en cambio en las proteinas, en su estructura secundaria se analizan las bandas de amida I, II y III, se confia mas en la banda de amida III porque la estructura secundaria esta mejor resuelta y esta region del espectro no encuentra interferencia.
Por tanto la tecnica FTIR se utilizo para observar cambios en lipidos de membrana, estructura secundaria de proteinas durante congelacion de las celulas tumorales de prostata LNCaP.
Las celulas se cultivaron en DMEM F-12 con FBS 5%, 1% de penicilina/estreptomicina solucion salina, 250nM dexametasona y 5% de CO2 a 37°C. la dependencia de temperatura a espectros de FTIR se estudiaron´por enfriamiento de la muestra de temperatura ambiente hasta -80°C.
La muestra se enfria a velocidad de -2°C/minuto mostrando formacion de hielo cerca de -10°C, se uso como nucleador Pseudomonas synringae lo que dio temperaturas de nucleacion desde -4 a -8°C.
la desidratacion celular y formacion de hielo intracelular son los modelos para predecir la biofisica celular de celulas tumorales LNCaP; dependiendo de variedad de temperaturas de congelacion y parametros especificos. Despues de la congelacion se preparan las muestras con yoduro de propidio que tiñe ADN solo de celulas con membranas modificadas, las celulas con daño se cuentan con microscopio de fluorescencia y se contaron de 3 a 5 campos que contenian de 30 a 40 celulas, esto corresponde a la viabilidad obtenida sobre la base de celulas vivas.
Los resultados indican que la formacion de hielo intracelular se evita cuando se da la nucleacion entre 0 y -4°C. A temperaturas inferiores a -4°C aumenta a % de formacion de este y a -6°C hay un 100% de incidencia en su formacion. la deshidratacion que se produce despues de la nucleacion reducira la cantidad total de hielo intracelular letal en estas celulas. entonces de 0 a -4°C hay disminucion en volumen celular con tendencia a formacion del hielo, de -4 a -6°C la deshidratacion y formacion de hielo ocurre al mismo tiempo y a temperaturas inferiores a -6°C hay deshidratacion minima y maxima formacion de hielo. si hay de 5 a 10% en agua en fase de hielo intracelular se considera letal para la mayoria de las celulas y a % menor se considera tolerado y puede correlacionarse con condiciones de supervivencia.
En el resultado de FTIR hay espectros de absorcion de infrarrojos a 20°C, 80°C y -80°C, dominado por la señal de agua o de hielo, la banda de amida I es visible a 1655cm-1 y a 1550cm-1 es visible la banda II, la region de la banda III va de 1330 y 1200 cm-1. la desnaturalizacion de la proteina coincide con el aumento brusco en formacion de estructuras extendidas en la hoja beta.
En cuanto a la membrana, la temperatura de su fase de transicion coincide con la temperatura a la cual se forma el hielo. esta temperatura afecta la nucleacion en la fase de transicion y la conformacion de la membrana en estado de congelacion. la desnaturalizacion en la membrana comienza a 48°C y la tasa de acumulacion de hoja beta helice a 66°C.
Variando la temperatura de 90°C a 20°C durante el enfriamiento se observan las bandas de las amida para determinar que este proceso de desnaturalizacion es irreversible, a pesar de que hay estabilidad durante la congelacion.
Como conclusion, la formacion de hielo intracelular es considerado la principal causa de lesiones en las temperaturas de nucleacion dependiendo de la velocidad de enfriemiento para diferentes tipos de celulas, en este caso, LNCaP asi como la deshidratacion es otra causa de muerte celular durante la congelacion.
La toleracncia muestra supervivencia en niveles intermedios de deshidratacion y formacion de hielo intracelular.
La deshidratacion se manifiesta como diaminucion en la fluidez de la membrana en estado de congelacion.
a -4°C en la nucleacion hay formacion del hielo, la desnaturalizacion se da a temperaturas mayores a 50°C y de 0 a 20°C por frio.
No hay comentarios:
Publicar un comentario